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La modificación más simple posible rescata la Expresión de Distrofia en Duchenne

La edición de un solo nucleótido en el gen humano más grande es suficiente para restaurar la producción de distrofina y la función de los miocitos en la distrofia muscular de Duchenne. La nueva investigación utiliza la edición de base y la edición principal que solo corta una sola cadena de ADN y reduce el riesgo de cambios genéticos dañinos.

Por: Gorm Palmgren – 3 de mayo de 2021

Se han aplicado varias estrategias de CRISPR para corregir algunas de las miles de mutaciones documentadas en el gen de la distrofina (DMD) que causan la distrofia muscular de Duchenne (DMD) – una enfermedad mortal que conduce a atrofia muscular progresiva y a debilidad. Aunque la mayoría de los intentos se han basado en la generación de roturas de doble cadena de ADN (DSB) mediante la actividad de nucleasa Cas9 convencional, solo unos pocos estudios han aprovechado la edición de base y la edición principal. Como estos métodos relativamente nuevos solo introducen cortes de una sola cadena y hacen un cambio mínimo en el genoma, pueden servir como alternativas potencialmente seguras y eficientes para la corrección genética de las mutaciones que causan la enfermedad de DMD.

Francesco Chemello (izquierda) es investigador postdoctoral en el laboratorio del profesor Eric Olson (derecha). Eric Olson es presidente fundador de biología molecular del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas. Foto cortesía de Eric Olson

El grupo de Eric Olson del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas en Dallas, Texas, siguió este enfoque para desarrollar una nueva estrategia de edición de genes CRISPR para la terapia de DMD que se publicó en Science Advances el viernes pasado. El equipo abordó una de las mutaciones más comunes causante de enfermedades, concretamente la supresión de exón 51 (∆Ex51) en DMD, que interrumpe el marco de lectura de la distrofia y genera un codón de parada prematuro en exón 52. Los investigadores lograron restaurar el marco de lectura tanto con la edición básica como con la edición principal al introducir la omisión de exón y el replanteo, respectivamente. En ambos casos, la estrategia restauró la expresión de distrofia en cardiomiocitos humanos y la función contráctil se normalizó utilizando la edición principal.

“Esta es la forma más sencilla posible que pudiéramos imaginar para restaurar la proteína distrofina mediante la edición de genes”

Eric Olson.

El hallazgo más importante de este artículo es que podemos editar el gen de la distrofia modificando un solo nucleótido – solo una letra en el código de ADN – y eso es suficiente para provocar la omisión de un segmento del gen que da como resultado la restauración de la proteína de distrofia faltante. Por tanto, este método ofrece una forma potencialmente segura y eficiente de corregir la DMD de la forma más sencilla posible, «afirma Eric Olson. También señala que el enfoque se puede adaptar para dedicarse a otras mutaciones en DMD.

Modelos de enfermedades en humanos y ratones probaron la estrategia

El grupo de Olson ha trabajado con Duchenne durante varios años, y en 2018 publicaron una revisión de las posibilidades de usar CRISPR en la terapia para la DMD. Su propio trabajo comenzó con investigación básica en muestras de pacientes y, después, pasó a modelos de enfermedad de DMD en animales. Explica Olson:

» En nuestros estudios iniciales, utilizamos una forma de CRISPR que corta ambas cadenas de la secuencia de ADN. En el presente documento, optimizamos y ampliamos aún más dicho procedimiento de corrección, por lo que no tenemos que cortar ambas cadenas, sino que solo necesitamos modificar una letra en una cadena para corregir la enfermedad. Esta es la forma más sencilla posible que pudiéramos imaginar para restaurar la proteína distrofia mediante la edición de genes. «

Esquema de los dos modelos de enfermedad (arriba), la estrategia de edición de base para la omisión de exón 50 (centro) y la estrategia de edición principal para el replanteo de exón 52 (abajo). Solo las células corregidas expresaron distrofia (derecha, verde).

Cortesía de Eric Olson.

El equipo utilizó un modelo de enfermedad de DMD tanto animal como humano en su trabajo experimental. El modelo animal empleó ratones con la mutación ∆Ex51 en su propio gen DMD de ratón. Estos ratones mostraron las características distintivas de la DMD, por ejemplo, ausencia de distrofina y reemplazo de fibras musculares con células inflamatorias y tejido graso. Para el modelo humano, Olson y sus colaboradores comenzaron con células madre pluripotentes inducidas (iPSC) de un donante masculino sano y utilizaron CRISPR-Cas9 para introducir la mutación ∆Ex51 en el gen DMD humano. A continuación, las células editadas se aislaron y se diferenciaron en cardiomiocitos. Sin una edición experimental posterior, los cardiomiocitos ∆Ex51 diferenciados carecían de expresión de distrofina, como se demostró mediante inmunohistoquímica.

Los editores base se dividen en dos para permitir la administración.

En su primer intento para corregir el gen de DMD de ratón mutado, los investigadores se centraron en el sitio aceptador del corte y empalme (SAS) o en el sitio donante de corte y empalme (SDS) de exón 50 o 52. La alteración de uno de estos sitios de corte y empalme impedirá que la maquinaria de corte y empalme reconozca dicho exón de modo que se omita y se restaure el marco de lectura correcto de la transcripción. Como los editores de base de adenina (ABE) pueden convertir un par de bases A:T en un par de bases G:C, pueden destruir las secuencias consenso canónicas de SAS y SDS, que son AG y GT, respectivamente.

» Desarrollamos esta estrategia denominada ABE de “intercambio único”, lo que significa que la edición de una sola letra en el sitio donante o aceptador del corte y empalme puede provocar la omisión del exón y restaurar el marco de lectura correcto del gen de la distrofina,« comenta Francesco Chemello. Él es investigador postdoctoral en el laboratorio Olson y co-primer autor del artículo reciente. El equipo utilizó un ABE optimizado, ABEmax, fusionado con un Cas9 diseñado que solo puede cortar una cadena de ADN, y luego probó nueve ARNsg candidatos por su capacidad para interrumpir los sitios aceptadores o donantes.

El equipo realizó las pruebas iniciales en células de neuroblastoma N2a de ratón. Uno de los sgRNA indujo una edición objetivo del 51% en la SDS de exón 50 con menos del 13% de actividad de los espectadores. La actividad del espectador es la edición de pares de base A:T adyacentes al sitio de destino. En este caso, uno se ubicó 2 nucleótidos corriente arriba y otro 4 nucleótidos corriente abajo del sitio objetivo. A continuación, este sgRNA se seleccionó para la edición de genes en vivo en el modelo de ratón utilizando el virus 9 adenoasociado (AAV9). Sin embargo, la construcción combinada ABEmax y Cas9 es demasiado grande para adaptarse al límite de empaquetado de 5 kb de los AAV, explica Chemello:

» Necesitábamos dividir la construcción en dos AAV diferentes, para que las dos proteínas parciales puedan recombinarse en la célula y formar un editor base funcional. «. Esto se logró utilizando el llamado sistema de empaquetado de inteína dividida previamente establecido por David Liu en el Instituto Broad de Harvard y MIT.

La omisión de exón restaura eficientemente la expresión de distrofina

La estrategia de edición de genes de intercambio único y el sistema de administración de inteína dividida de AAV se validaron en el modelo de ratón ∆Ex51 mediante inyecciones intramusculares en la pierna. Tres semanas después, la secuenciación del ADN genómico reveló una eficiencia de edición en el objetivo del 35%. El análisis de transferencia de Western reveló que la expresión de la proteína distrofina se había restaurado al 54% de los niveles de tipo salvaje – ascendiendo de aproximadamente 5% en las células ∆Ex51 sin editar. Además, la inmunohistoquímica reveló que la expresión de distrofina se restauró en 96.5% de las miofibras y la infiltración inflamatoria se redujo notablemente.

El equipo también probó la eficacia de la estrategia de edición de genes de intercambio único en un modelo de enfermedad humana. En primer lugar, se seleccionó un sgRNA con 38% de edición en objetivo en la SDS de exón 50 utilizando células humanas HEK293T. En segundo lugar, las iPSC de ∆Ex51 humanas se nucleofectaron con este sgRNA y la maquinaria de edición base. Se aislaron clones individuales de células editadas –88% de las cuales contenían la edición en el objetivo – y se diferenciaron en cardiomiocitos.

La preservación de la estructura muscular normal se restaura después de la edición “ Eric Olson.

Los análisis de secuencia de ADN de estos cardiomiocitos derivados de iPSC editados revelaron el corte y empalme de exón 49 al 52, lo que indica que había tenido lugar la omisión deseada de exón 50. Al igual que en el modelo de ratón, los cardiomiocitos editados mostraron restauración de la expresión de la proteína distrofina conforme a lo revelado por el análisis de transferencia Western y la inmunocitoquímica.

Entonces, la estrategia de edición de genes de intercambio único para la omisión de exón 50 funciona tanto en células humanas como murinas. Y, como señala Eric Olson, la estrategia también ejerce cambios funcionales que alivian la enfermedad en los músculos de ratones.

» Ese es un punto importante porque, en esta enfermedad, el tejido muscular se destruye y se reemplaza por una cicatriz fibrótica y una infiltración de grasa, por lo que la estructura muscular normal se conserva después de la edición,” comenta.

La dosis de AAV debe reducirse

Los prometedores resultados en vivo en el modelo de ratón se obtuvieron en células musculares cercanas al sitio de inyección utilizando una dosis viral elevada. Pero uno de los desafíos con AAV son las altas dosis que se requieren para proporcionar expresión en todo el cuerpo. Entonces, el laboratorio de Olson ya está trabajando para resolver ese problema.

» Creemos, en base a nuestros estudios preliminares, que finalmente podemos entregar esta maquinaria de edición de genes con una dosis de AAV que esté por debajo del límite de toxicidad. Pero esos son algunos de los problemas en los que estamos trabajando ahora, « comenta Eric Olson. Esto se logra en parte guiando los AAV hacia las células que necesitan corrección.

» Solo queremos realizar la corrección donde se necesita, es decir, en los músculos esqueléticos y en el corazón, por lo que utilizamos este serotipo específico AAV9 que se dirige principalmente a estos dos órganos. Además, como segunda capa de seguridad, utilizamos el promotor de creatina quinasa 8 que impulsa la expresión de alto nivel específicamente en el músculo esquelético y en el corazón. « explica Chemello. El investigador postdoctoral agrega que el equipo también necesitará utilizar un Cas9 más pequeño para que toda la construcción pueda acomodarse en un solo AAV.

La edición principal normaliza la contracción en cardiomiocitos humanos con DMD

Olson, Chemello y el resto del equipo se dedicaron a la edición principal para corregir la DMD que causa la mutación ∆Ex51 en cardiomiocitos humanos. Esta es la primera vez que se utiliza la edición principal para la corrección de DMD. En este caso, la estrategia se basó en insertar dos nucleótidos en el exón 52 para restaurar el marco de lectura. La edición principal utiliza un Cas9 diseñado que solo corta una cadena del ADN (nCas9) fusionado a una transcriptasa inversa. Un ARN guía de edición principal (pegRNA) se utiliza para múltiples propósitos y consiste en un sgRNA que se hibrida con el sitio objetivo, un andamio para nCas9, una plantilla de transcripción inversa que contiene la edición deseada y un sitio de unión del cebador que se une a la cadena no objetivo. En este caso, se incluyó un sgRNA de corte adicional para aumentar la eficiencia de edición al favorecer la reparación del ADN para reemplazar la cadena no editada.

Estrategia de edición de genes para restaurar el ORF mediante el replanteo de exón con edición principal (A). Ilustración del pegRNA utilizado en los experimentos (rojo), la secuencia de ADN objetivo (azul) y la inserción programada (verde). De Science Advances (2021) 7: eabg4910

Después de una serie de pasos de optimización, el equipo seleccionó dos conjuntos de pegRNA y sgRNA de corte que condujeron a una eficiencia de 20% y 54% en la introducción de una inserción de +2-nt en la posición deseada en iPSC ∆Ex51. A continuación, se diferenciaron clones individuales de células editadas en cardiomiocitos donde se pudo confirmar el replanteo correcto en exón 52 tanto mediante análisis genéticos como mediante la restauración de la expresión de la proteína distrofina.

Además, los cardiomiocitos editados se sometieron a análisis de ciclos de calcio para probar si la edición principal podía rescatar el defecto arrítmico observado en los fenotipos de los pacientes. Estos experimentos mostraron que el 65% de los cardiomiocitos ∆Ex51 sin editar tenían trazas de calcio arrítmicas. Este fue, sin embargo, solo el caso en alrededor de 40% de los cardiomiocitos con edición principal – un número muy cercano al obtenido de los cardiomiocitos de control sanos de 37%.

“Esta nueva investigación se suma a la caja de herramientas de tecnologías de edición del genoma que podemos implementar para corregir defectos genéticos.” Eric Olson.

» Nuestro siguiente paso será demostrar si esta tecnología también funciona para otras mutaciones en DMD. Nuestro objetivo a largo plazo es trasladar este trabajo a la clínica, pero aún no tenemos un cronograma específico establecido. Tenemos que asegurar la seguridad y seguir optimizando los métodos de entrega,« comenta Olson. Concluye:

» Esta nueva investigación se suma a la caja de herramientas de tecnologías de edición del genoma que podemos implementar para corregir defectos genéticos. Puede depender del tipo de mutación cuál de esas tecnologías será la más efectiva. Cada vez somos más optimistas y con esperanza acerca de nuestro camino hacia un nuevo tratamiento para la DMD.«

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